样本间的变异性影响eDNA定量，并对估计生物多样性有重要意义
主题
基于环境DNA（eDNA）的监测已成为水域系统生物多样性调查的成熟且高效的方法。然而，需要比较和标准化不同生态系统类型的采样方法，尤其是像河口这样复杂的生态系统，因为环境因素波动导致监测鱼类种群存在独特挑战。本文比较了利用四种不同eDNA过滤方法从eDNA元条码数据中获得的物种丰富度：三种不同孔径（0.45、1.2和5微米）的手工过滤方法，以及一种新建立的被动方法——宏探针。该研究在一个超潮汐河口生态系统的盐度梯度中进行。总体而言，四种方法共检测到44种鱼类。0.45微米滤波器回收了最高的丰富度（39个物种），其次是超探针法（35个），再到1.2微米（34个）和5微米（33个）滤波器。盐度梯度间的滤光性能显示，0.45微米和1.2微米方法在所有采样区域中恢复了最高的物种丰富度。0.45微米在使用各区域代表物种时，检测概率也最为一致。虽然0.45微米方法似乎是最优方法，但每种方法都可以被视为在河口和河流等动态生态系统中进行生物监测的可行且可比的选择。特别是，首次在淡水系统中使用的被动元探针表现优于手动过滤方法，尽管部署时间较短。本研究为利用eDNA基因形态编码优化河口生态系统中的鱼类多样性评估提供了关键见解，为未来全球类似系统的监测工作提供了宝贵框架。
1 简介
在复杂环境中监测生物，如河口系统中的鱼类，带来了不同采样方法带来的挑战（Alenzi 2024）。传统鱼类监测依赖于捕获、目视识别和计数标本（Radinger 等，2019;Franco 等，2022），采用了鳃网/围网捕捞、电网捕捞、束流拖网和休闲钓鱼等方法（Magaju 等，2023;Baldino等，2018年），以及较少危害的方法，如潜网捕捞（Collas等，2021年）。然而，这些方法具有侵入性，且实施成本高昂。基于DNA的方法的应用，特别是环境DNA（eDNA）元条码——即同时扩增/测序多个物种的DNA——已成为监测生物多样性的成熟且高效的方法（Taberlet等，2012;奥格登 2022）。eDNA元条形编码作为监测工具的价值在全球多种水生生态系统中得到了充分证明（Rees等，2014;McDevitt 等，2019;Valentin 等，2020;Sales等，2021）。
然而，电子DNA监测并非没有挑战，尤其是在河口采样时，河口具有复杂的混合动力学和密度梯度（Sanches和Schreier 2020;DiBattista 等，2022）。与海洋、湖泊和河流水质较为均匀不同，河口涵盖了海洋和淡水。这导致盐度梯度强烈且变化大，并有大量再悬浮沉积物（Williams等，2017）。捕捉eDNA最常用的工具是包裹在塑料滤芯内的过滤膜，连接手动或机械注射器/泵，强行将水通过膜（Deiner等，2015;Miya等，2016;Capo等，2020）。这些滤纸有不同孔径，即膜表面微孔大小，单位为微米（μm）。这些孔径允许水通过，同时捕捉膜表面的遗传物质。eDNA研究常用的孔径范围为0.22至5微米（Turner等，2014;Thomas 等，2018）。在河口采样eDNA的一个复杂问题是重浮沉积物的含量，这可能导致这些过滤器迅速堵塞（Williams等，2017;Sanches 和 Schreier 2020）。较大的孔隙预计会减少堵塞，从而过滤更多水。然而，这并不一定会带来更高的DNA产量（Kumar等，2022），因为较小的DNA片段可能无法被保留（Jo等，2022）。
虽然存在电子DNA采样的标准化指南（例如，Bruce等，2021），但它们相对有限（Hirsch等，2024），且在滤膜堵塞仍是关键限制的环境中调整这些协议仍存在挑战（Sanches和Schreier，2020）。当前的解决方案，如自动探针或多重过滤器池化（Hunter 等，2019;Hendricks 等，2023），对于大规模或资源有限的监测项目来说，成本可能过高，并且可能限制基于eDNA的监测的普及。为避免手工过滤和滤网堵塞带来的挑战，有人提出使用被动采样器（Bessey 等，2021）。这涉及在水源中放置吸收材料，然后在不同时间范围内被动积累电子DNA颗粒（Jeunen等，2022;Verdier 等，2022;Chen 等，2024）。最近，一种新的被动采样器——元探针，提供了与更传统过滤方法相当的结果（例如0.2微米滤波器;Maiello 等，2022,2024）。 然而，其效率尚未在河口或淡水环境中进行评估，且仅部署于海洋环境中，通常置于渔网内并从渔船抛出（Maiello 等，2024;Sbrana 等，2024）。
本研究旨在优化eDNA元条码作为监测工具，评估河口生态系统中鱼类生物多样性，以默西河口为案例。默西河口位于英格兰西北部（见图1），其特点是强烈的潮汐力（Bowden 1963），导致高湍流和沉积物重新悬浮。历史上，这里曾支持着生态和经济上具有重要性、现已受保护物种的繁荣种群，包括大西洋鲑鱼（Salmo salar）、欧洲鳗鱼（Anguilla anguilla）、银鱼（Osmerus eperlanus）、七鳃鳗（Lampetra sp. 和 Petromyzon marinus）以及褐鳟（Salmo trutta）（联合自然保护委员会 2007）).然而，19世纪和20世纪的工业污染导致栖息地严重退化，使其数十年来生物贫瘠（Jones 2000， 2006）。近期的恢复举措带来了显著的生态改善（Kim 和 Batey 2021），在长时间缺席后，仍有显著的大西洋鲑鱼及其他物种被目击（Mawle 和 Milner 2003;琼斯 2006;Buysse 等人，2008;Ikediashi 等，2012）。这里，我们比较了4种过滤方法（0.45、1.2、5微米及超探针），覆盖河口下游（海洋）、中部（半咸水）和上游（淡水）三个站点。这些区具有明显的物理化学梯度，使我们能够评估过滤性能随环境条件的变化，并将为未来全球河口生物多样性监测的eDNA采样策略提供参考。
图1
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幻灯塔
默西河口的采样点：上游区三个（橙色菱形），四个中部区（粉色圆圈），三个下区（蓝色三角形）。
2 方法与材料
2.1 学习区
默西河口从沃灵顿附近的上潮限延伸至爱尔兰海的利物浦湾，全长约60公里（见图1）。该河口为超潮汐区，春季潮汐在河口处为~10米（在小潮时为~4米），为半昼性，每天有两次类似的潮汐周期（Lane 2004）。来自爱尔兰海的咸水与淡水输入混合，主要来自默西河，该河长期平均流量为37米3/秒（立方米每秒）。低流量条件，以Q95为代表（流量超过95%），平均9.4米3每秒，而高流量条件（Q5，超过5%的时刻）可达93米3/s（国家河流流量档案2024）。这些动态形成了一个高度活跃、混合良好的河口，形成了沿河岸连续体的物种分布结构（Elliott 和 McLusky 2002）。
本研究选取了河口北岸的10个采样点，涵盖系统内三个不同区域。在河口上游主要是淡水区，采样了三个地点（U1、U2和U3）。河口中心区域形成河口浊度极大值（ETM），即沉积物湍流再悬浮导致的最高浊度区（Geyer 1993）。该区形成了大型混合区，海水与淡水汇聚。总共选定了四个采样点（C1、C2、C3和C4），因为该区域更为突出（宽度约5公里），且因ETM带来的复杂性增加。下游河口主要是海洋区，另有三个样本点被指定（L1、L2和L3;图1）。
2.2 电子DNA过滤方法
评估了四种不同的方法：孔径为0.45微米（Sterivex）、1.2微米（Whatman）、5微米（KX尼龙）的注射器过滤器，以及一种被动方法——超探针（见图S1）。样本于2022年11月、12月及2023年1月间，每月三天采集，涨潮时每天3至4个采样点，因多个采样点在退潮时常干燥。每个月，每种方法在10个站点各采集三次重复样本，实验中共收集了360个eDNA样本。使用注射器过滤器的三种方法中，水样采集于单个1升消毒桶中，每次复制使用一个桶。每个采样日开始时，使用密封瓶装水采集一次1升田间空白水复制样本。每个注射器过滤器都使用60毫升注射器手动将水通过过滤膜。采集后立即在现场进行水样过滤。当每个注射器滤芯的复制品堵塞到无法再推水时，记录过滤的体积（表S4–S6），滤芯被密封在一个无菌气密袋中，并在实验室中保存至−20°C，直到处理完成。异次探针方法在萨尔福德大学专门的eDNA洁净室中制备，随后进行田野调查。单卷（三卷代表三个复制品）尺寸相同（10×10厘米）医用纱布被固定在超探针球内壁，并用消毒过的钢带固定。每个超探针准备三根含有99%乙醇的50毫升Falcon管，用于取样后储存纱布。准备好的超探针和猎鹰管被密封在无菌袋中，直到部署到各自采样点，即注射器过滤方法完成后立即部署。变探针通过快挂挂在20米长的绳索上（见图S2），并在每个地点抛入水中5分钟。在展开超探针之前，在每个采样日开始时，将单场空白纱布置于含99%乙醇的Falcon管中。部署后立即，将超探针小心切开，每卷纱布放入预先准备好的独立Falcon管中，并在−20°C下保存直到提取DNA。5分钟时长是基于其他方法中过滤一次复制的平均时间确定的，因此在所有测试方法中实现了相同的抽样时长。
2.3 DNA提取与扩增
所有DNA提取均在专用eDNA洁净室内进行，并由佩戴全套个人防护装备（如工装、手套、发网、口罩和一次性靴子）的人员在提取前至少6小时通过紫外线进行消毒。DNA提取遵循Mu-DNA协议（Sellers等，2018），该方案针对注射器过滤方法的水样和超探针过滤法的土壤样本量身定制。选择土壤提取方法是为了考虑元探针的独特特性，即其收集和积累颗粒物（通常悬浮的沉积物），使样本组成更接近土壤。共处理了360份eDNA样本和36个阴性对照组，包括现场和实验室空白样本。
测试了两种不同的引物集：MiFish-U/E 和 Tele02。MiFish-U/E 引物靶向 12S rRNA 基因的超变区（163–185 碱基），在淡水环境中被广泛应用（Miya 等，2015）;Tele02 引物扩增 12S 基因中约 167 碱基对的片段，专门针对硬骨鱼（Taberlet 等，2018）。虽然两种引物均成功扩增了目标基因区域，但MiFish引物在半咸水和海水样本（即中部和下区采集的样本）中，扩增的是来源不明的非目标片段（见图S3A），而Tele02引物主要扩增鱼类特异性靶点片段（见图S3B）。由于与MiFish引物在所有采样区的引物不一致，提取的DNA使用鱼类特异性Tele02引物进行扩增（Taberlet等，2018）。为考虑可能的标签跳跃和污染，包含了阳性（Hoplias malabaricus，一种新热带淡水物种）和阴性PCR对照（即使用无核酸酶水而非eDNA）的PCR反应。
PCR在六个平衡平衡的文库中制备（90卷纱布——每个文库15卷，270卷注射器滤纸样本——每个文库45个，12个现场空白样本——每个文库2个，12个提取空白文库（每个文库2个），12个PCR阴性对照组（每个文库2个），12个PCR阳性对照组（每个文库2个;每个文库共68个样本），每个文库三份PCR进行。每个样本均使用Teleo02引物扩增，包括一个独特的8碱基对寡果标签，连接在正反引子上，以及可变数量（2–4）的前导N（完全简并位置），以增加扩增子序列的变异性。采用单步协议进行PCR扩增，以最大限度减少单个反应的偏倚。PCR反应总体积为20微升，其中包括10微升AmpliTaq金360主混合液（1X;应用生物系统）、0.16微升BSA（20 mg/mL）、两种引物各1微升（5微米）、5.84微升超纯水和2微升eDNA模板。所有文库的PCR扩增均在以下热循环条件下进行：95°C持续10分钟，随后95°C循环40次30秒，60°C循环45秒，72°C循环30秒，最终延长72°C循环5分钟。
随后将复制体合并，并将样品置于涂有GelRed染色的1.2%琼脂糖凝胶上，以检测靶片是否成功扩增。随后用HighPrep PCR净化系统磁珠纯化PCR产品，左侧尺寸选择时采用1.1×比。纯化后的文库在安捷伦2200 TapeStation上使用高灵敏度D1000屏幕带（安捷伦科技）进行可视化。这表明靶片段右侧存在次级非靶产物，通过右侧尺寸选择（所有文库的比值为0.8×）被去除。
通过Qubit dsDNA HS测定套件（Invitrogen）使用Qubit 4.0荧光仪定量了选定的DNA。基于总DNA浓度，每个文库被稀释至20 ng/μL，体积为50 μL以制备文库。端修复、适配器连接和文库PCR扩增均使用KAPA HyperPrep Kit，按照制造商协议完成。文库通过定量PCR（qPCR）在MIC qPCR系统（生物分子系统）上，使用NEBNext库定量套件（Illumina，新英格兰生物实验室）进行定量定量。库1和2、3和4以及5和6被按等摩尔浓度合并，形成了最后三个库。所有文库均在晚上9点（共3次测序运行）在Illumina MiSeq Reagent v2（300周期）试剂套件（Illumina Inc.）上测序。
