loligo游泳隧道的应用之斑马鱼吞噬能力升高主导先天性脊髓修复
•斑马鱼脊髓损伤后，富含脂质的杂质被高效清除
•脊髓修复需要短暂的微胶质细胞/巨噬细胞反应
•TCIM的丧失会损害脂质加工、吞噬作用和功能修复
•斑马鱼或小鼠巨噬细胞中TCIM的表达加速了碎屑和脂质清除
摘要
脊髓损伤（SCI）后，免疫细胞会引发一系列转录状态。在哺乳动物中，低效的碎片清除和慢性炎症阻碍了恢复，掩盖了促进再生的免疫功能。我们发现斑马鱼脊髓损伤会引发短暂的免疫激活和高效的碎片清除。转录组学和基因消融显示斑马鱼巨噬细胞高度吞噬，且对再生至关重要。斑马鱼与哺乳动物巨噬细胞的比较发现，转录和免疫反应调节因子（TCIM）是一种免疫富集的再生基因。斑马鱼TCIM的缺失会损害吞噬作用和再生，并激活白细胞中的促炎特征。斑马鱼和小鼠巨噬细胞中的tcim表达通过促进脂质代谢和髓系前体重编程为活化吞噬细胞，确立了其保守作用。本研究强调了实现先天脊髓修复需要提高吞噬能力，并鉴定出哺乳动物细胞中功能保守的基因。
图形摘要

关键词:脊髓再生,小胶质细胞∙巨噬细胞∙吞噬作用∙神经免疫学∙免疫清除∙脂质代谢∙斑马鱼∙脊髓损伤
研究课题
CP：神经科学∙CP：免疫学
简介
脊髓损伤（SCI）会引发多细胞和全身性并发症，导致哺乳动物永久性神经功能缺损。1,2,3作为抵御神经损伤的第一道防线，免疫细胞在受伤后数小时内就被激活，并在人类脊髓损伤后持续多年。4,5,6中枢神经系统（CNS）的免疫激活作用于组织中的小胶质细胞和血液来源白细胞。SCI发生后，中性粒细胞和病灶附近的小胶质细胞吞噬细胞残渣，招募浸润的免疫细胞进入脊髓（SC）。7,8,9,10在稳态条件下不穿越血SC屏障的不同先天和适应性免疫细胞群体，依次招募到SC病灶中。9,11,12,13然而，免疫细胞的时间线、组成和激活特征因损伤类型、严重程度和部位而极为多样。14,15,16,17因此，免疫细胞在哺乳动物脊髓损伤后会采取一系列转录状态和功能输出。
免疫细胞激活在哺乳动物脊髓损伤后具有双重作用，难以解密。与哺乳动物脊髓损伤修复的炎症反应加剧一致，使用抗炎药物治疗或广泛耗尽小胶质细胞/巨噬细胞可改善小鼠脊髓损伤后的功能恢复。18持续的慢性炎症是继发性神经毒性、胶质细胞反应性以及瘢痕沉积性成纤维细胞招募到病变的主要原因。19最近开发的用于急性脊髓损伤中靶向微胶质细胞/巨噬细胞消融的工具揭示了小鼠早期免疫激活的需求。15,20,21,22单细胞转录组学的出现提供了分子证据，表明微胶质细胞/巨噬细胞是高度可塑的细胞，存在于多种情境依赖的激活状态谱中。17,23然而，特定免疫谱与其对应的表型输出之间的相关性仍有待进一步研究。哺乳动物脊髓损伤后免疫反应的异质性和复杂性，为解读哺乳动物促再生免疫机制带来了复杂难题。
成年斑马鱼为理清脊椎动物促进再生免疫功能提供了宝贵模型。与哺乳动物类似，斑马鱼免疫系统包括进化上保守的先天骨髓和适应性淋巴细胞分支，以及中枢神经系统驻留的小胶质细胞。24,25然而，与哺乳动物不同，成年斑马鱼在完全断裂后能够恢复功能性恢复。26,27,28,29斑马鱼免疫细胞脊髓损伤反应的研究仅限于不同的免疫亚群和/或幼虫阶段。30,31,32在3天大斑马鱼幼虫中阻断免疫激活，确立幼虫SC修复的免疫需求，会降低功能和解剖学上的再生。30,31然而，小胶质细胞发育迁移到斑马鱼中枢神经系统的时间会超过受精后15天，25而成熟斑马鱼的淋巴细胞则在受精后一个月才会出现。33,34在成年斑马鱼中，调控T细胞被证明是SC修复所必需的。32然而，需要一份全面的白细胞组成和激活特征资源，以解读成年斑马鱼的促进再生免疫细胞状态和机制。
吞噬能力有限和清除残骸效率低下与哺乳动物脊髓损伤相关，并抑制脊髓损伤修复。35病变索的细胞外环境充满了由碎屑衍生的含脂分子，这些分子是轴突再生的强效抑制剂。36退化性寡突胶质细胞释放的分子，包括神经突生长抑制剂（Nogo）和髓鞘相关糖蛋白（MAG），会导致生长锥塌陷和神经突缩回。37,38脂质丰富残渣的低效处理会将吞噬细胞转化为富含脂质的泡沫细胞，这些泡沫细胞在人类脊髓损伤中持续数月至数年。5,39,40高炎症性、泡沫状巨噬细胞会引发慢性炎症并限制再生能力。8,41,42,43,44我们假设像斑马鱼这样高度再生的脊椎动物会引发强效的吞噬特性，从而在受伤后高效清理碎片。虽然制定增强吞噬能力的策略是改善脊髓损伤后恢复的前提，但要确定斑马鱼和哺乳动物之间吞噬能力的差异及其差异，仍需跨物种比较和机制研究。
本研究考察成年斑马鱼对脊髓损伤的促进再生免疫反应。我们报告了短暂且可逆的免疫细胞激活，主要由浸润型和组织驻留型巨噬细胞组成。急性和亚急性脊髓损伤期间的遗传巨噬细胞耗竭会损害功能和解剖学的再生。斑马鱼与哺乳动物巨噬细胞的跨物种比较发现，转录与免疫反应调节因子（TCIM）是巨噬细胞富集的斑马鱼基因。斑马鱼TCIM的遗传缺失会损害再生，导致脂滴过度积累和吞噬能力下降。相反，遗传中TCIM的过度表达通过将髓系前体重新编程为活化的吞噬细胞，加速残骸清除和再生。本研究阐明了再生型和非再生型脊椎动物在应对脊髓损伤时免疫细胞和分子结构的根本差异，并提出实现先天修复SC需要更高的吞噬能力。
选举结果
成年斑马鱼脊髓损伤后会激活急性、短暂的免疫反应
我们首先试图探讨对脊髓损伤有反应的白细胞组成。与之前在斑马鱼幼体和小鼠中的发现一致，4,6,30中性粒细胞是最早对脊髓损伤反应的白细胞，受伤后12小时达到高峰（见图S1A和S1B），而T细胞在感染后14天（dpi）表现出最大浸润（见图S1C和S1D）。然而，只有10.6%的白细胞为1 dpi的中性粒细胞，14.5%的白细胞为T细胞（图S1E），表明斑马鱼脊髓损伤后，中性粒细胞和T细胞仅占Lcp1白细胞的较小部分。接着我们分析了Tg（mpeg1.1：YFP）鱼类的SC切片，以评估浸润和组织驻留巨噬细胞，剂量介于1至56 dpi之间。+45受伤前，mpeg1.1白细胞平均为每节22.3±3.3个（图1A–1C）。脊髓损伤后，组织常驻和浸润巨噬细胞的剂量从0提升至3 dpi，增加了12倍（见图1A–1C）。巨噬细胞数目恢复到损伤前的28 dpi水平（见图1A–1C）。mpeg1.1+−Lcp1白细胞在病变部位数量较少，且很少浸润超过300微米，进入头部或尾部的SC实质（见图1B）。因此，虽然激活的白细胞在脊髓损伤后哺乳动物组织中仍会持续进入慢性损伤期，+46,47斑马鱼对脊髓损伤的免疫反应是短暂的。这些研究表明，浸润型和组织常驻巨噬细胞是成年斑马鱼对脊髓损伤反应的主要白细胞群体，并揭示了急性吞噬细胞激活与鳞状细胞再生之间的相关性。
图1 微胶质/巨噬细胞反应在SC再生后是短暂的
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斑马鱼脊髓损伤后，髓鞘碎片被高效清除
为评估斑马鱼脊髓损伤后碎片清除的程度，我们对Tg（mpeg1.1：YFP）鱼类的髓鞘片进行了髓鞘碱性蛋白（Mbp）染色。未受伤的脊髓切片中包围髓鞘轴突的Mbp在SCI后在病变部位形成碎屑聚集体（见图1D）。我们在未受伤的SC切片中发现了极少的Mbp聚集。SCI后，Mbp聚合分别在1和3 dpi时增长了8.1倍和6.9倍（见图1D和1E）。到5 dpi时，病灶部位的Mbp聚集在统计上与对照组相当（见图1E）。SC实质内Mbp点的清除范围延长至28 dpi（见图1E），明亮的Mbp点在远端SC中与mpeg1.1细胞共定位，直到56 dpi（见图1F）。这些数据表明小胶质细胞在脊髓损伤后数周至数月参与髓鞘重塑，支持先前研究在14 dpi时病灶远端区域小胶质细胞激活的报告。++++++48然而，病变部位内高效的髓鞘碎片清除是斑马鱼脊髓损伤后提升再生能力的独特特征。
MPEG1.1巨噬细胞/微胶质细胞是SC再生所必需的+
为了检验短时吞噬细胞激活是否对 SC 再生必要，我们使用了 Tg（mpeg1.1：NTR-IRES-EGFP）鱼类去除了 mpeg1.1 细胞。+49通过这种诱导的遗传消融系统，mpeg1.1驱动的硝基还原酶（NTR）表达催化甲硝唑（MTZ）前药，形成细胞毒性产物，从而实现mpeg1.1细胞的自主消融。+50由于巨噬细胞在耗尽后会迅速更换，因此需要持续的MTZ脉冲来维持mpeg1.1细胞的耗竭（图2A）。该脉冲MTZ处理在3 dpi下降低了74.4%的Lcp1细胞（见图S1F）。巨噬细胞耗竭的动物在14和28 dpi的游泳耐力均较对照组下降（见图2B）。利用顺行轴突追踪和Gfap免疫染色，++27与对照组组相比，近端轴突再生和病灶间胶质连接显著减少，对照组在28 dpi下显著减少（见图2C–2F）。虽然在14 dpi时去除MTZ足以让mpeg1.1细胞重新繁殖到SC组织，但延迟巨噬细胞出现不足以在14至28 dpi之间进行再生（见图1C–1F）。mpeg1.1细胞的耗竭也消除了病变部位7 dpi时Mbp碎屑的清除（见图1G和1H）。这些结果表明，mpeg1.1吞噬细胞对于成年斑马鱼的脊骨再生和清除杂质至关重要。++++
